PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶用戶(hù)指南

——高性能Taq酶助力高通量PCR與基因組研究

一、產(chǎn)品概述

PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶 是KAPA Biosystems（羅氏診斷旗下品牌）研發(fā)的高性能Taq DNA聚合酶，專(zhuān)為高通量PCR、長(zhǎng)片段擴(kuò)增及二代測(cè)序（NGS）文庫(kù)制備設(shè)計(jì)。該酶通過(guò)直接分子進(jìn)化平臺(tái)優(yōu)化，具備超高保真性、抗抑制劑能力及擴(kuò)增長(zhǎng)片段DNA的優(yōu)勢(shì)，適用于復(fù)雜模板的擴(kuò)增與基因組學(xué)研究。

核心參數(shù)：

• 貨號(hào)：PKR2016

• 規(guī)格：100 units/支（可滿(mǎn)足50次50 μL反應(yīng)）

• 保存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融

• 有效期：24個(gè)月（未開(kāi)封）

• 適用領(lǐng)域：醫(yī)療衛(wèi)生、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種、合成生物學(xué)等

二、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 超高保真性

• 錯(cuò)誤率：2.8×10??（通過(guò)大規(guī)模二代測(cè)序驗(yàn)證），顯著低于野生型Taq酶（1×10??）。

• 應(yīng)用場(chǎng)景：適合SNP分型、基因編輯靶點(diǎn)驗(yàn)證、突變檢測(cè)等對(duì)保真性要求高的實(shí)驗(yàn)。

2. 抗抑制劑能力

• 耐受性：可耐受血液、土壤、糞便等樣本中的PCR抑制劑（如腐殖酸、血紅素、肝素）。

• 優(yōu)勢(shì)：無(wú)需復(fù)雜樣本預(yù)處理，直接用于臨床樣本、環(huán)境樣本的擴(kuò)增。

3. 擴(kuò)增長(zhǎng)片段DNA

• 最大擴(kuò)增長(zhǎng)度：基因組DNA可達(dá)15 kb，質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA可達(dá)18 kb。

• 應(yīng)用場(chǎng)景：全長(zhǎng)cDNA合成、BAC克隆擴(kuò)增、長(zhǎng)片段測(cè)序文庫(kù)制備。

4. 高通量適配性

• 反應(yīng)速度：擴(kuò)增速度較傳統(tǒng)Taq酶提升30%，適用于96孔板、384孔板自動(dòng)化操作。

• 靈敏度：可檢測(cè)低至1個(gè)拷貝的模板DNA，適用于稀有樣本分析。

三、操作指南

（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 試劑與耗材

• PKR2016 KAPA第二代基因工程酶（貨號(hào)PKR2016）

• 引物（終濃度100-900 nM）

• DNA模板（1 ng–1 μg，根據(jù)目標(biāo)片段長(zhǎng)度調(diào)整）

• PCR緩沖液（含Mg2?，無(wú)需額外添加）

• 無(wú)核酸酶水

2. 儀器設(shè)置

• 預(yù)變性：95℃ 3分鐘

• 30-40個(gè)循環(huán)：95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分鐘/kb

• 終延伸：72℃ 5分鐘

• 溫度程序：

• 熒光通道：若結(jié)合熒光探針（如FAM、HEX），需選擇兼容的qPCR儀。

（二）實(shí)驗(yàn)操作

1. 反應(yīng)體系配制（以50 μL體系為例）：

   
   

   成分	體積（μL）
   PKR2016酶（2 U/μL）	0.5
   10×緩沖液	5
   dNTPs（2.5 mM）	4
   正向引物（10 μM）	1
   反向引物（10 μM）	1
   DNA模板	1-100 ng
   無(wú)核酸酶水	補(bǔ)足至50

   
   

2. 加樣與離心

• 使用單通道或多通道移液器加樣，避免氣泡。

• 離心（2000 × g，1分鐘）確保液體沉至管底。

3. PCR程序

• 預(yù)變性：95℃ 3分鐘

• 循環(huán)：30-40個(gè)循環(huán)（95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分鐘/kb）

• 終延伸：72℃ 5分鐘

（三）NGS文庫(kù)制備優(yōu)化

1. 文庫(kù)擴(kuò)增：

• 使用PKR2016替代傳統(tǒng)酶，可提高文庫(kù)復(fù)雜度與覆蓋均一性。

• 推薦反應(yīng)體系：25 μL（含10 ng文庫(kù)模板）。

2. 質(zhì)量控制：

• 通過(guò)Qubit或Agilent Bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)濃度與片段分布。

（四）數(shù)據(jù)分析

1. 擴(kuò)增效率驗(yàn)證

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：計(jì)算斜率（-3.32±0.1）確認(rèn)反應(yīng)效率（90%-110%）。

• 熔解曲線(xiàn)分析：?jiǎn)我环逍捅砻魈禺愋詳U(kuò)增。

2. 長(zhǎng)片段擴(kuò)增驗(yàn)證

• 使用λ噬菌體DNA（48.5 kb）測(cè)試擴(kuò)增能力，目標(biāo)片段長(zhǎng)度≥15 kb。

三、使用技巧與高效操作

1. 模板預(yù)處理

• 對(duì)高GC含量模板（>65%）使用DMSO（5%-10%）或甜菜堿（1-2 M）輔助擴(kuò)增。

• 對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，建議使用KAPA FFPE DNA修復(fù)試劑盒預(yù)處理。

2. 引物設(shè)計(jì)

• 引物長(zhǎng)度18-25 bp，Tm值58-62℃。

• 避免二級(jí)結(jié)構(gòu)與引物二聚體（使用Primer-BLAST或OligoAnalyzer評(píng)估）。

3. 反應(yīng)條件優(yōu)化

• 延伸時(shí)間：根據(jù)目標(biāo)片段長(zhǎng)度調(diào)整（1 kb/分鐘）。

• 退火溫度：通過(guò)梯度PCR確定最佳Tm值（±5℃）。

四、注意事項(xiàng)

1. 安全規(guī)范

• 避免反復(fù)凍融，分裝后保存于-20℃。

• 操作時(shí)佩戴手套，避免RNA酶污染。

2. 操作細(xì)節(jié)

• 移液精度：使用校準(zhǔn)后的移液器，誤差<±1%。

• 加樣順序：先加緩沖液與酶，再加引物和模板，最后加dNTPs與水。

3. 故障排除

• 無(wú)擴(kuò)增信號(hào)：檢查引物質(zhì)量、模板濃度及反轉(zhuǎn)錄效率。

• 非特異性擴(kuò)增：提高退火溫度或縮短延伸時(shí)間。

五、用戶(hù)評(píng)價(jià)與支持

• 用戶(hù)反饋：

• “PKR2016顯著提高了長(zhǎng)片段PCR的成功率，擴(kuò)增效率優(yōu)于競(jìng)品。"

• “在FFPE樣本中，該酶的抗抑制劑能力顯著減少了優(yōu)化步驟。"